Nuevas determinaciones de vitamina C

 En una entrada anterior teníais los datos de los volúmenes de lugol utilizados para valorar la concentración de vitamina C en el primer lote de pimientos. Aunque es recomendable que realicéis los cálculos, os adjuntamos un gráfico con los resultados de aquellos pimientos.

Valores de ácido ascórbico (vitamina C) en pimientos madurados en ciclos luz/oscuridad.

Nos llamó entonces la atención de que los niveles más bajos de ácido ascórbico fuesen los registrados por los pimientos tratados con melatonina. De hecho, en el proyecto del curso anterior habíamos observado que determinadas variedades de pimientos presentaban mayores niveles de vitamina C cuando habían sido rociados con melatonina.

Ante la incertidumbre, decidimos repetir de nuevo las medidas. En esta ocasión se necesitaron volúmenes más bajos de lugol, pero como se ve en la gráfica de abajo, de nuevo eran los pimientos tratados con melatonina los que presentaban menos vitamina C. 

Valores de ácido ascórbico (vitamina C) en pimientos madurados en ciclos luz/oscuridad.

 

En estos días hemos tratado un nuevo lote de pimientos con nuestras moléculas señalizadoras, pero en este caso, nuestra parte del experimento consistía en hacer que madurasen en oscuridad. Teníamos entonces que hacer nuevas determinaciones bioquímicas para estos pimientos, y optamos por hacerlo y volver a repetir los de los pimientos anteriores. La gráfica muestras los valores de la tercera determinación:

Valores de ácido ascórbico (vitamina C) en pimientos madurados en ciclos luz/oscuridad.

De nuevo los pimientos tratados con melatonina mostraban la menor concentración de vitamina C.

En cuanto a los pimientos madurados en oscuridad, estos son los resultados:

Valores de ácido ascórbico (vitamina C) en pimientos madurados en oscuridad.

 ¿Qué diferencias hay entre los resultados de ambos tratamientos? ¿Se mantiene la tendencia del experimento anterior? ¿Podéis proponer alguna explicación para justificar los resultados?

Valoración de los pigmentos de nuestros pimientos

 Con nuestro primer lote de pimientos hicimos la pertinente medida de pigmentos fotosintéticos. En una entrada anterior teníais los valores de las lecturas del espectrofotómetro y os invitábamos a que calculaseis la concentración de clorofila a, clorofila b y carotenoides en nuestras muestras. Con el segundo lote de pimientos volvemos a valorar el contenido de pigmentos de los pimientos madurados en condiciones de oscuridad con los tratamientos indicados, en este caso sin valorar pimientos tratados con etanol ni con capsaicina. 

Independiente de que es recomendable que hagáis los cálculos y practiquéis con concentraciones, al igual que en clase de Química, os mostramos aquí los gráficos con las concentraciones de pigmentos.

En primer lugar los valores del primer experimento

Valoración de pigmentos fotosintéticos en frutos de pimientos madurados en condiciones de iluminación circadianas en nuestro laboratorio.

 

Los valores del segundo experimento se muestran en el gráfico siguiente.

Valoración de pigmentos fotosintéticos en frutos de pimientos madurados en condiciones de oscuridad en nuestro laboratorio.

 ¿Qué opináis de los resultados de cada experimento? ¿Y de la comparación de ambos experimentos?

Los valores de Brix y pH de nuestro segundo experimento

En las entradas anteriores habéis observado cómo ha ido cambiando el estado de maduración de nuestros pimientos mantenidos en oscuridad. Debido al estado de los mismos procedimos a su procesamiento para mantenerlos congelados para futuros análisis. Pero aprovechando que tratábamos los frutos, aprovechamos para realizar las pruebas más sencillas: el pH y el contenido de azúcares sobles (Brix).

Los resultados para el pH han sido los siguientes:

                                Agua:                         4    4                    Media:     4
                                GSNO:                       4    4                    Media:     4

                                NaHS:                        4    4                    Media:     4

                                Melatonina:                5    5                    Media:     5                 

Los resultados para el Brix han sido los siguientes:

                                Agua:                     6    6    6                   Media:     6
                                GSNO:                   6    7    6    6             Media:     6,25

                                NaHS:                    6    6    6                   Media:     6

                                Melatonina:            6    6    6                   Media:     6     

Como sabéis, las condiciones de maduración de estos pimientos ha sido diferente a la de los anteriores. Los primeros lo hicieron según los ciclos de luz y oscuridad del laboratorio mientras que los segundos lo han hecho en oscuridad, metidos en cajas y protegidos por plásticos negros.

Ahora es el momento de valorar los resultados del análisis actual y de compararlo con los resultados anteriores (ver la entrada correspondiente). ¿Hay diferencias apreciables en el pH y en el contenido de azúcares solubles entre ambos grupos de pimientos? ¿Qué conclusiones podéis extraer de la comparación? Compartimos los resultados en los comentarios.

Analizamos los pigmentos de nuestros pimientos

Una de las formas de valorar el grado de maduración de los frutos de pimientos es a través del análisis de los pigmentos fotosintéticos. No olvidemos, al ser frutos climatéricos, los pimientos cortados verdes no maduran, pero cuando este proceso se ha iniciado (y los pimientos muestran zonas que comienzan a enrojecer) continua hasta que el pimiento se vuelve rojo. Cuando los frutos son verdes, los niveles de clorofilas son muy altos, pero a medida que maduran se reduce el contenido de estas moléculas en favor de los carotenoides, de color rojo.

El pasado viernes dedicamos la sesión del proyecto a valorar los pigmentos fotosintéticos de los pimientos. Un día antes habíamos preparado los extractos triturando 0,9 gramos de fruto en 18 mL de etanol. Las muestras se dejaron macerando en el frigorífico durante 20 horas. Pasado este tiempo se centrifugaron los extractos a 5000 rpm durante 5 minutos y se estudió la absorbancia con la ayuda del espectrofotómetro. Las medidas se hacen a longitudes de onda de 470 nm, 649 nm y 665 nm. En algunos casos, y dada la concentración de carotenoides, se hicieron diluciones para no superar el umbral de medida del espectrofotómetro.

 

La tabla anterior muestra las lecturas,  ya corregidos los valores en función de las diluciones que se hicieron. Como véis, para cada muestra se tomaron tres medidas, a las que se ha hallado el valor medio. A partir de estos datos podemos calcular la concentración de clorofila a, clorofila b y carotenoides gracias a las ecuaciones de Pompelli:

Clorofila a (μg/mL) = 13,36 x A664 - 5,19 x A649

 Clorofila b (μg/mL) = 27,43 x A649 - 8,12 x A664

Carotenoides totales (μg/mL) = [1000 x A470 - 2,13 x (Clorofila a) - 97,64 x (Clorofila b)] /209

 

 Con los valores medios de la tabla anterior hay que calcular la concentración de pigmentos en los frutos según el tratamiento.  Esperamos los valores que obtengáis en los comentarios.

El aspecto de nuestros nuevos pimientos tras los tratamientos

 Nuestro segundo lote de pimientos se sometió a los tratamientos el pasado martes 10 de marzo en la Estación Experimental del Zaidín. Hoy lunes damos por finalizada esta parte del experimento y es el momento de valorar el aspecto fenotípico que presentan nuestros pimientos. En la clase de hoy nos dedicamos a analizar su grado de madurez y a comparar los distintos tipos entre sí. Las fotos de abajo muestran el estado de los pimientos.

¿Qué conclusiones sacáis acerca de nuestros frutos? ¿Qué diferencias observáis entre ellos? Estas observaciones son muy importantes para la marcha de nuestro proyecto. Adelante con los comentarios.

 

ASpecto de nuestros pimientos el viernes 13 de marzo

Nuestros pimientos continúan madurando en oscuridad. Este es el aspecto que presentaban el viernes 13 de marzo.

Nuestros nuevos pimientos continúan madurando

Nuestros pimientos en oscuridad continúan madurando. Estas son las fotos que indican cómo han cambiado en estos dos días en función de los distintos tratamientos. Como podéis ver la variación es apreciable. ¿Veis algunas diferencias en la maduración entre los tratamientos? ¿Os atrevéis a proponer alguna hipótesis?

Estudiamos la maduración de una nueva tanda de pimientos

El proyecto está mostrando resultados muy prometedores. Tanto es así que vamos a estudiar la maduración de un nuevo lote de pimientos, con alguna modificación en cuanto al diseño experimental. Se van a tener en cuenta algunas de las sugerencias que habéis dado. Nosotros nos vamos a encargar de un lote que se va a mantener en oscuridad; en la Estación Experimental del Zaidín analizan otro lote semejante pero en este caso, sometiéndo a los pimientos a un ciclo circadiano de luz y oscuridad. De los pimientos que tenemos en el laboratorio, la mitad los mantendremos en oscuridad y la otra mitad se llevarán este viernes a la EEZ para completar la maduración entonces con ciclos circadianos.

En esta ocasión los tratamientos los pusieron José Manuel Palma y Carmelo Ruiz en la EEZ. Nosotros los hemos pesado y los mantenemos en cajas en oscuridad. Cuidamos también de darle la vuelta cada día y de hacer fotos para ver la evolución. Las fotos iniciales y la del estado de los pimientos pasado un día se muestran a continuación.

Iremos añadiendo las fotos en días sucesivos.

Y ahora unas fotos del dispositivo experimental con el que estudiamos los nuevos pimientos.

 

Analizamos el contenido de vitamina C de nuestros pimientos

 La vitamina C, también conocida como ácido ascórbico, es un potente antioxidante que no es exclusivo de frutos cítricos, como las naranjas o los limones. Como bien nos ha contado nuestro investigador, los futos de los pimientos son muy ricos en este producto, tato que bastan unas decenas de gramos de pimiento crudo para satisfacer nuestras necesidades diarias de vitamina C. Por ello y por la variación que pueda presentar el contenido de ácido ascórbico en los frutos maduros en función de los tratamientos es por lo que se hace necesario estudiar su contenido en esta sustancia.

Para valorar la cantidad de vitamina C que hay en una muestra debemos utilizar una reacción específica que nos permita cuantificarla. El almidón es un polisacárido que reacciona específicamente con el lugol, un compuesto que tiene iodo. Si a una solución de almidón le añadimos unas gotas de lugol, se tornará violeta oscuro. La vitamina C previene frente a esta reacción, por lo que si añadimos a la solución de almidón vitamina C, no aparecerá el color morado mientras ésta no se consuma en esa reacción. Cuánto más ácido ascórbico contenga la solución con almidón, más lugol tendremos que añadir para conseguir que aparezca el color morado en el tubo de ensayo. 

A partir de la cantidad utilizada de lugol podremos estimar la concentración de vitamina C. En su momento preparamos una curva patrón con soluciones de ácido ascórbico de concentración conocida; medimos la cantidad necesaria de lugol para que apareciese color y los resultados se muestran en la gráfica de abajo. 

Esta curva nos permite predecir qué cantidad de lugol necesitaremos para que nos dé positiva la reacción ante una cantidad de vitamina C conocida. Pero alternativamente, y esto es lo importante, conociendo la cantidad de lugol añadido, sabremos que cantidad de ácido ascórbico tendremos en una muestra, ya que la reacción se rige por las leyes de la proporcionalidad, como se dijo antes. Un sencillo procedimiento matemático nos permite, además, obtener una ecuación (la ecuación de la recta de regresión que vemos en la figura) que nos permite relacionar ambos valores. Basta con sustituir en la fórmula el volumen de lugol empleado.  En nuestro caso la ecuación se expresa de la siguiente forma:

Volumen de lugol en microlitros = 95,479 · cantidad de vitamina C (en un mililitro)

Para calcular la cantidad de vitamina C que tenemos en las muestras, despejamos esa incógnita según la expresión

                Cantidad de vitamina C = 95,479 / volumen de lugol

En nuestro experimento del viernes, partimos de seis gramos de muestra de pimiento que trituramos en tampón. A partir del extracto, valoramos la concentración de vitamina C en 0,5 ml de extracto de pimiento. Esto es importante para averiguar la concentración final en el pimiento. Los resultados de las medidas que realizamos el viernes han sido los siguientes:

A partir de aquí toca hacer los cálculos de la concentración de vitamina C en cada uno de los tubos aplicando la ecuación anterior. Considerad que la cantidad que hemos calculado era el contenido de vitamina C en 0,5 mL de extracto de pimiento y que hemos puesto 1 mL de tampón por cada gramo de pimiento.  Es simplemente un problema de concentraciones, como los que tenéis que saber hacer en Química. Por favor, anotad vuestros resultados en los comentarios. Y a modo de despedida, unas fotos del viernes.