El último día de clase valoramos el contenido de proteínas de nuestros pimientos, utilizando el método colorimétrico de Bradford (Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent). Para ello, utilizaremos los extractos de pimiento que habíamos preparado en tampón TRIS y que teníamos congelados. Tomamos 5 microlitros de dichos extractos y los depositamos en tubos ependorf; añadimos 795 microlitros de agua destilada y finalmente ponemos 200 microlitros de reactivo de Bradford. Dejamos actuar 10 minutos y leemos en el espectrofotómetro a 595 nm. El blanco lo prepararemos con 800 microlitros de agua destilada a los que añadiremos, igualmente, 200 microlitros de reactivo de Bradford. Los valores que registramos se muestran en la tabla siguiente:
Para calcula la concentración de proteínas de nuestros extractos nos basaremos en una curva patrón que tenemos preparada para concentraciones conocidas de albúmina bovina.
Lectura del espectrofotómetro = 0,0642·cantidad de proteínas en microgramos + 0,0281
¿Qué resultados habéis obtenido? Compartidlos en comentarios.
Lectura del espectrofotómetro = 0,0642·cantidad de proteínas en microgramos + 0,0281
ResponderEliminarDespejamos:
Cantidad de proteínas en mcg = ( Lectura del espectrofotómetro - 0,0281) / 0,0642
Las concentraciones de proteínas en los diferentes tratamientos son :
En el ciclo circadiano:
- Agua: 1,86 μg
- GSNO: 1,30 μg
- NaHS: 1,33 μg
- Etanol: 0,96 μg
- Melatonina: 1,36 μg
- Capsaicina: 1,43 μg
En oscuridad:
- Agua: 1,88 μg
- GSNO: 1,24 μg
- NaHS: 1,99 μg
- Melatonina: 1,82 μg
A partir de estos resultados, podemos decir que la concentración de proteínas depende del tratamiento aplicado y de las condiciones de luz.
En el caso del agua, los valores son prácticamente constantes en ambos casos ( tanto en ciclo circadiano como en oscuridad). Sin embargo, se observan diferencias claras en los otros tratamientos:el GSNO presenta una mayor concentración de proteínas en condiciones de luz ( ciclo circadiano) . Por el contrario, la melatonina y el NaSH presentan valores más elevados en oscuridad. Además, los pimientos tratados con etanol son los que presentan los valores más bajos de concentración proteica.
En conclusión, hay algunos tratamientos en los que la luz favorece la acumulación de proteínas , mientras que en otros es la ausencia de la luz la que la favorece. Por lo tanto, la luz influye en la cantidad de proteínas, pero su efecto depende de cada tratamiento.
Muy bien, Safae. Muy buen comentario, buen análisis de resultados.
EliminarUsando la ecuación de la curva de regresión, y utilizando los valores medios de nuestras medidas, he llegado a estos resultados:
ResponderEliminarproteínas= (Absorbancia - 0,0281)/0,0642
Ciclo Circadiano:
-Agua (0,148 - 0,0281)/0,0642=1,87
-GSNO (0,112 - 0,0281)/0,0642=1,31
-NaHS (0,114 - 0,0281)/0,0642=1,34
-Etanol (0,90 - 0,0281)/0,0642=0,96
-Melatonina (0,116 - 0,0281)/0,0642=1,37
-Capsaicina (0,120 - 0,0281)/0,0642=1,43
En oscuridad:
-Agua (0,149 - 0,0281)/0,0642=1,88
-GSNO (0,108 - 0,0281)/0,0642=1,24
-NaHS (0,156 - 0,0281)/0,0642=1,99
-Melatonina (0,145 - 0,0281)/0,0642=1,82
Según los cálculos realizados a partir de la curva de regresión, las muestras presentan diferentes concentraciones de proteínas. En el ciclo circadiano, la muestra con agua presenta una de las mayores concentraciones, mientras que el etanol tiene la más baja. En condiciones de oscuridad, el NaHS presenta la mayor cantidad de proteínas.
A partir de estos resultados, se podría pensar que algunos tratamientos, como el NaHS, favorecen la presencia de proteínas en los extractos, mientras que otros, como el etanol, podrían reducirla. Sin embargo, las diferencias no son tan grandes como para afirmarlo.